التشخيص القائم على cfDNA يمكن أن يجعل خزعة الأنسجة قديمة
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. الخزعات المكلفة والغازية للكشف عن رفض الطعم بعد الزرع لها قيود عديدة. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. خضعت الفحوصات المستندة إلى الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) - وهي أجزاء متداولة من الحمض النووي المنطلق من الخلايا والأنسجة والأعضاء أثناء موت الخلايا الطبيعية - إلى دراسة مكثفة مؤخرًا ويمكن أن تحسن في نهاية المطاف قدرتنا على اكتشاف الرفض وتنفيذ التغييرات السابقة في الإدارة ، وحتى تعزيز البقاء على المدى الطويل للأعضاء المزروعة.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. تفترض CfDNA أن التحايل على الحاجة إلى تسلسل الجينوم الكامل (WGS) والحاجة إلى معرفة مسبقة بالأنماط الجينية المتبرعة و / أو المتلقية لها مزايا لوجستية قوية وهي حاليًا قيد الفحص السريري. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. بالإضافة إلى ذلك ، ساعد تحسين معرفة الحركية الخاصة بالأعضاء في cfDNA المشتقة من الجهات المانحة (dd-cfDNA) بعد الزرع أيضًا على تحسين هذه المقايسات. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. أدخلت المختبرات أيضًا طرقًا بديلة لقياس كمية dd-cfDNA ، مثل تفاعل سلسلة البلمرة المتسلسلة الرقمية (PCR) وأنماط مثيلة DNA DNA الخاصة بالأعضاء. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. على هذا النحو ، يعد مجال التشخيصات الأقل بضعاً القائم على cfDNA واعدًا بشكل متزايد ، ويحتمل في يوم من الأيام استبدال الخزعات التقليدية للأنسجة.
دور CFDNA في الرفض العضوي
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. الرفض ، يشير إلى إصابة العضو المتبرع به بسبب الجهاز المناعي للمتلقي ، يمكن أن يسبب خللًا في وظيفة الطعم الخيالي وحتى وفاة المريض. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). يحدث الرفض الخلوي الحاد بوساطة الخلايا التائية (ACR) في أغلب الأحيان خلال الأشهر الستة الأولى بعد الزرع (1). ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ينطوي ACR على تراكم خلايا CD4 + و CD8 + T في الفضاء الخلالي للطعم الخيالي حيث يتعرف نظام المناعة لدى المستلم على المستضدات على العضو المتبرع به كأجنبي. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. تبدأ هذه الخلايا التائية في شلال مناعي يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) للخلايا المستهدفة. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). عندما تموت هذه الخلايا ، يتم انقسام DNA الجينومي ويتم إطلاق شظايا من dd-cfDNA ، بقياس حوالي 140 زوجًا أساسيًا (bp) ، للانضمام إلى تجمع cfDNA المتلقي في الدم ويتم إخراجه في النهاية في البول (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. تم استخدام cfDNA المتداول مؤخرًا كأداة تشخيصية لتحل محل الخزعات الغازية في مجالات أخرى من الطب ، بما في ذلك تحليل شظايا DNA الجنينية داخل الدورة الأمومية لتحديد التشوهات الوراثية في الرحم وتسلسل DNA المنتشر من الخلايا السرطانية لتحديد الطفرات المرتبطة بالسرطان. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). في كلتا الحالتين وكذلك في عملية الزرع ، يميز التسلسل عالي الإنتاجية الذي يحدد ويقيس اختلافات تسلسل الحمض النووي بين المجموعتين المختلفتين من cfDNA المستمدة من مصادر مميزة (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. هناك ثلاث خصائص لـ cfDNA تجعلها علامة بيولوجية مرشحة ممتازة غير باضعة للكشف عن الرفض بعد زرع الأعضاء الصلبة: يمكن الحصول عليها من سحب الدم البسيط ، وقياس تركيزه بدقة ، وتسلسل النوكليوتيدات بسهولة تحديده. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. استخدام cfDNA كمؤشر حيوي لـ ACR مفيد أيضًا لأنه مشتق من الخلايا المصابة في العضو المتبرع به ، وبالتالي يجب أن يمثل مقياسًا مباشرًا لموت الخلية الذي يحدث في الطعم المغاير. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). علاوة على ذلك ، يحافظ cfDNA على جميع السمات الجينية للحمض النووي الجينومي الأصلي ، مما يسمح بالتمييز بين المادة الوراثية المنبعثة من العضو المتبرع به عن cfDNA المستمدة من خلايا المتلقي التي تخضع لاستماتة طبيعية (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. يعد الرصد المتكرر والدقيق لصحة الطعم أمرًا ضروريًا لبقاء المتلقين على المدى الطويل. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). لزرع القلب (HT) ، خزعة بطانة القلب (EMB) هي المعيار الذهبي الحالي للكشف عن ACR (4). However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). ومع ذلك ، فإن الإدارة الانتخابية مكلفة مع قيود كبيرة ، وكثير منها مشترك لجميع خزعات الأعضاء (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). علاوة على ذلك ، فإن الطبيعة الغازية لمؤسسات الإدارة الانتخابية تضع مرضى HT في خطر الإصابة بمضاعفات (6،8،9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). لسوء الحظ ، تفتقر الطرق غير الجراحية المتاحة حاليًا بما في ذلك تخطيط صدى القلب أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) إلى الخصوصية والحساسية الكافية للكشف بشكل موثوق عن الرفض (10-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). تمثل المؤشرات الحيوية القائمة على الدم ، مثل cfDNA ، بديلاً واعدًا يمكن تنفيذه بسهولة في الممارسة السريرية (14-17).
حركية CFDNA خلال الهدوء والاعتراض
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). نظرًا لأن cfDNA ينشأ من عملية الاستموات التي تحدث بشكل طبيعي ، فإن جميع الأفراد لديهم مستويات يمكن اكتشافها من cfDNA في دمائهم (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. بالنسبة للأفراد الأصحاء ، تأتي غالبية cfDNA المنتشرة من خلايا المكونة للدم التي خضعت لموت طبيعي مرتبط بالدوران الخلوي. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). تتقلب مستويات cfDNA لأسباب متعددة بما في ذلك العدوى أو الجراحة أو الصدمة أو حتى التمارين الشاملة (2،19). Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. لذلك ، يتطلب تطوير مقايسة تعتمد على cfDNA للكشف عن الرفض تقييم الخواص المتوقعة لإطلاق dd-cfDNA في الدورة الدموية للمستقبل بعد الزرع. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). هذا الاعتبار مهم بشكل خاص لأن إطلاق dd-cfDNA بمرور الوقت بعد الزرع هو خاص بالأعضاء (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). على سبيل المثال ، في يوم واحد بعد HT ، يبلغ متوسط مستوى dd-cfDNA 3.8 ± 2.3٪ (20). However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). ومع ذلك ، وبحلول 7 أيام ، انخفض مستوى dd-cfDNA بسرعة ولا يزال منخفضًا باستمرار (<1٪). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. خلال نوبة الرفض الحاد في القلب ، وجد أن مستوى dd-cfDNA يزداد إلى 4٪ - 5٪ من خط الأساس لحوالي 0.06٪ الذي لوحظ خلال فترة السكون. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). كانت حركية dd-cfDNA التي لوحظت في تداول متلقي HT مماثلة لتلك التي لوحظت بعد الزرع الكلوي (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. في المقابل ، وجد أن المتلقين لعمليات زرع الرئة الثنائية لديهم متوسط جزء dd-cfDNA من 26 ± 14٪ في اليوم الأول بعد الجراحة. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). علاوة على ذلك ، اتسم الانخفاض في dd-cfDNA بمستويات dd-cfDNA التي تراجعت بسرعة خلال الأسبوع الأول ثم تباطأت وبقيت بشكل عام عند 1٪ -3٪ (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. ومع ذلك ، على غرار عمليات زرع القلب والكلى خلال حلقة من الرفض الحاد ، زاد مستوى dd-cfDNA بشكل ملحوظ ، حيث ارتفع إلى متوسط 14 ٪ -15 ٪.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. تفسر الاختلافات في كتلة الأنسجة ومعدلات دوران الخلايا لهذا التباين في مستويات dd-cfDNA التي تم إطلاقها في وقت مبكر بعد الزرع وأثناء السكون. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). على سبيل المثال ، يمكن تفسير الاختلافات في تعميم مستويات dd-cfDNA في عمليات زرع ثنائية وثنائية الرئة الهادئة عن طريق الاختلاف في دوران الخلايا ، كونها 107 مقابل 58 خلية / ثانية ، على التوالي (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). على النقيض من ذلك ، في القلب الهادئ المزروع ، يبلغ معدل دوران الخلايا 8 خلايا فقط في الثانية (21-23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. وبالتالي ، فإن فهم المستويات المتوقعة من dd-cfDNA المرتبط بعضو صلب معين أمر ضروري لتسهيل تطوير الاختبارات الخاصة بالأعضاء التي تكشف عن الرفض. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. بمجرد فهم حركيات إطلاق cfDNA لعضو معين ، توجد عدة طرق لتحديد الكمية النسبية لـ dd-cfDNA.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. استراتيجيات تمييز المستفيد - ضد. DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA مشتقة من DONOR
عدم تطابق الجنس بين المتلقي والمتلقي
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). بالنسبة لعمليات زرع الأعضاء التي يكون فيها المتبرع ذكرًا والمتلقي أنثى ، يمكن للمختبرات الاستفادة من عدم التطابق الجنسي هذا لحساب مستويات dd-cfDNA من داخل مجموع cfDNA الخاص بالمستلم (17). Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). أظهر الباحثون لأول مرة جدوى هذا النهج في عينات البول المأخوذة من الإناث المتلقين لعملية زرع الكلى الذين تلقوا الكلى من المتبرعين الذكور ، وعندما عانوا من الرفض ، أظهروا مستويات مرتفعة من dd-cfDNA في بولهم الذي يحتوي على مناطق موجودة على الكروموسوم Y بشكل خاص ( 17). Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. على الرغم من أن هذا النهج يسمح بالتشخيص الواثق للرفض في الطعم المغاير ، فإن عدم تطابق الجنس بين المتبرع والمتلقي نادر الحدوث وغير قابل للتطبيق عالميًا.
الاختلافات في تسلسل الحمض النووي بين الجهات المانحة والمتلقية
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. يمكن أيضًا اعتبار عملية زرع الأعضاء عملية زرع جينوم ، حيث تحتوي الخلايا الموجودة داخل العضو المزروع على المعلومات الوراثية للمتبرع له. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). على هذا النحو ، يعتمد مفهوم ديناميات زرع الجينوم (GTD) على وجود اختلافات جينية بين المتبرع والمتلقي في موضع معين ، والتي يمكن الاستفادة منها لتحديد أصل cfDNA المتداول (20-24). Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). من الناحية المثالية ، سيكون المتلقي متماثل الزيجوت لقاعدة واحدة (على سبيل المثال ، AA) وفي نفس المكان يكون المتبرع متماثلًا لقاعدة مختلفة (على سبيل المثال ، GG).
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). بالنظر إلى عدم التجانس الوراثي بين الأفراد ، يمكن استجواب عشرات الآلاف من المواقع التي قد تكون غنية بالمعلومات عبر الجينوم باستخدام التسلسل عالي الإنتاجية للتمييز بين dd-cfDNA و cfDNA المتلقي (20،24). This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. تم توضيح هذا المفهوم لأول مرة باستخدام عينات مصرفية من المتبرعين القلبيين للحصول على أنماط وراثية مسبقة من كل متبرع لكل زوج. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. بعد استخراج وتسلسل cfDNA من كل متلقي ، تم تحديد جزء الجزيئات الخاصة بالجهات المانحة. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). في العينات المأخوذة أثناء أو قبل حدث رفض مثبت للخزعة ، تبين أن نسبة تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية الخاصة بالجهات المانحة قد زادت من <1٪ إلى> 3٪ - 4٪ (24).
This early retrospective study has now been validated prospectively. تم التحقق من صحة هذه الدراسة الاسترجاعية المبكرة مستقبلاً. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). تم تجنيد الأشخاص البالغين والأطفال في القلب وزرع الرئة وتم الحصول على الأنماط الجينية لكل زوج من المتبرعين والمتلقيين من خلال WGS بمتوسط 53.423 علامات SNP إعلامية تم تحديدها (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). بشكل عام ، كان الكشف المبكر عن الرفض الحاد أعلى من AlloMap ، وهو أول نهج غير جراحي معتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء للكشف عن ACR بعد HT بناءً على تحليل transcriptome (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. وقد أظهرت الأبحاث أيضًا أن WGS لا توفر فقط معلومات حول الكسب غير المشروع ولكن أيضًا فيروم المريض والحالة العامة لقمع المناعة. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). هذا يمثل ميزة كبيرة محتملة لا يمكن الحصول عليها بواسطة المقايسات الأخرى (26-28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. ومع ذلك ، تواجه WGS تحديات يمكن أن تحول دون تنفيذها بشكل روتيني في الممارسة السريرية. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. على سبيل المثال ، في حين أنه يمكن الحصول على المعلومات الجينية للمستلم بسهولة ، فإن هذا لا ينطبق دائمًا على المتبرع. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. علاوة على ذلك ، فإن WGS مكلفة ومكلفة للعمل وتستغرق وقتًا طويلاً.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). تستخدم طريقة بديلة لوحة من SNPs متعددة الأشكال الجينية تم تحديدها داخل تجمع cfDNA المستخرج وبالتالي القضاء على الحاجة إلى معرفة مسبقة من النمط الجيني المحدد للمتبرع (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. على عكس عمليات زرع الكلى والكبد ، والتي تحدث غالبًا بين الأفراد المتصلين ارتباطًا وثيقًا ، فإن أزواج المتبرعين والمتلقين لعمليات زرع القلب والرئة لا ترتبط عادةً. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. يتطلب مرض ورم الأرومة الغاذية الحملي التنميط الجيني لكل من متلقي الزرع والمتبرع. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، غالبًا ما تكون معلومات النمط الجيني للجهات المانحة غير متوفرة. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. هنا ، نعالج هذه المشكلة من خلال تطوير خوارزمية تقدر مستويات dd-cfDNA في غياب النمط الجيني المانحة. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. تتنبأ خوارزمياتنا برفض الطعم الخيطي للقلب والرئة بدقة مماثلة لـ GTD التقليدي. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. علاوة على ذلك ، قمنا بتحسين الخوارزمية للتعامل مع المتلقين والمتبرعين ذوي الصلة الوثيقة ، وهو سيناريو شائع في نخاع العظام وزرع الكلى. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. نظهر أنه من الممكن تقدير dd-cfDNA في مرضى زرع النخاع العظمي الذين ليس لديهم علاقة أو هم أشقاء من المتبرعين ، باستخدام نموذج ماركوف المخفي. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. لذلك ، تم تطوير خوارزميات لزرع القلب والرئة والتي تفترض أن النمط الجيني للمتبرع يحدث بنفس تواتر عامة السكان. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. استنادًا إلى هذه الترددات والمقارنة مع النمط الجيني المعروف للمستلم ، يمكن تقدير جزء من dd-cfDNA بشكل موثوق من إجمالي مجموعة cfDNA المعزولة من عينة بلازما المستلم.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. في حالة زرع الرئة ، وجد أن نموذج الجينوم المفرد هذا ، عند مقارنته بالمنهجية التي تستخدم كلاً من الأنماط الجينية المانحة والمتلقية ، يوفر أجزاء مماثلة من dd-cfDNA. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. ومع ذلك ، عندما طبق الباحثون نفس الخوارزمية على HT ، لم تكن المستويات المقدرة من dd-cfDNA مرتبطة ارتباطًا وثيقًا كما هو الحال في عمليات زرع الرئة. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. قد يكون هذا مرتبطًا بالمبالغ المطلقة المنخفضة لـ dd-cfDNA الموجودة بعد HT. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). هذا مثال آخر على حركية cfDNA الخاصة بالأعضاء والتي يمكن أن تؤثر على نتائج الفحص ويجب أخذها في الاعتبار (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. في حالة الزرع الكلوي ، تم إجراء دراسات مستقبلية للتأكد من فائدة مستويات dd-cfDNA ، التي تم تحديدها باستخدام SNPs المعروفة الخاصة بالجهات المانحة ، كعلامة قابلة للتطبيق للرفض. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). في إحدى هذه الدراسات ، تم تجنيد 384 من متلقي الكلى من 14 موقعًا سريريًا لتقديم عينات الدم على فترات محددة وفي أوقات الخزعات الموضحة سريريًا (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. بشكل عام ، ركزت الدراسة على العلاقة بين الأنسجة في 107 عينات خزعة من 102 مريض ومستويات dd-cfDNA الموجودة في عينات البلازما المتطابقة. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. وبشكل أكثر تحديدًا ، تم الحصول على 27 عينة خزعة من 27 مريضًا مع الرفض النشط جنبًا إلى جنب مع 80 عينة خزعة من 75 مريضًا دون رفض نشط.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. في هذه الدراسة ، تضمن الرفض النشط الرفض الحاد بوساطة الأجسام المضادة (AMR) ، و AMR المزمن ، و ACR. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). استخدمت المقايسة المستخدمة في هذه الدراسة قطعًا بنسبة 1 ٪ لجزء من dd-cfDNA للإشارة إلى وجود أو عدم وجود رفض نشط ووجد أن لديه خصوصية 85 ٪ (95 ٪ CI ، 79 ٪ - 91 ٪) وحساسية 59 ٪ (95٪ مجال ثقة ، 44٪ -74٪). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). كانت حساسية هذا الاختبار أكبر للتمييز بين AMR النشط والغياب ، حيث وجد أن استخدام 1٪ dd-cfDNA له خصوصية 83٪ (95٪ CI ، 78٪ -89٪) و 81٪ حساسية (95٪ مجال ثقة ، 67٪ - 100٪). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. ومن الجدير بالذكر ، في كلتا الحالتين ، انخفضت الحساسية بشكل كبير عندما تجاوز جزء dd-cfDNA 3٪.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). لتحسين خصوصية وحساسية مقايسة cfDNA غير الغازية للكشف عن الرفض بعد الزرع الكلوي ، قام الباحثون أيضًا بمسح الكمية المطلقة من dd-cfDNA (32-33). By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. من خلال استجواب الكمية المطلقة من dd-cfDNA ، يمكن للمرء أن يزيل التغييرات الاصطناعية في جزء dd-cfDNA بسبب الزيادات في مستويات cfDNA الإجمالية الناجمة عن أحداث عدم الرفض ، مثل العدوى أو الصدمة أو التمرين ، مما قد يخلق المزيد من فحص دقيق.
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). للتحقيق في هذا الاحتمال ، استخدمت إحدى الدراسات 32 متغيرًا لأرقام النسخ الإعلامية (CNVs) استنادًا إلى الترددات السكانية ، على النقيض من النسب النسبية لـ SNPs المانحة والمتلقية في مكان معين (32). All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. لذلك ، افترض أن جميع CNVs غير موجودة داخل جينوم المتلقي ولكنها موجودة داخل cfDNA المستخرج تمثل dd-cfDNA.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. ومن المثير للاهتمام ، أنه بينما تحسنت الخصوصية والحساسية بشكل عام باستخدام مستويات dd-cfDNA المطلقة ، كان لهذا الاختبار أيضًا قدرة أكبر على التمييز بين وجود وغياب AMR النشط ، على عكس حالات ACR النشط. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن مستويات الكرياتينين في الدم كافية في التمييز بين الرفض النشط والهدوء ، على الأرجح لأنها أكثر دلالة على وظيفة الكبيبة على عكس تلف أنسجة الكلى (31-33).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). استكشفت دراسة أخرى المستويات المطلقة لـ dd-cfDNA في متلقي عمليات زرع الكلى المتعلقة بمستويات تاكروليماس ، وهو مثبط مناعي (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. هنا ، وجد الباحثون أن الكمية المطلقة من dd-cfDNA كانت أعلى بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من انخفاض مستويات التاكروليماس (<8 ميكروغرام / لتر) مقارنة مع أولئك الذين لديهم مستويات أدوية أعلى. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. تشير هذه البيانات إلى أن مستويات dd-cfDNA لديها أيضًا القدرة على الكشف عن إصابة طعم خيفي ناتجة عن عدم كفاية المناعة.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. كما اقترحت المختبرات بدائل لـ WGS. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). استكشفت مجموعتنا التسلسل المستهدف لـ 124 SNPs متعددة الأشكال (تردد أليل طفيف [MAF]> 0.4) باستخدام لوحة متاحة تجاريًا ، وتسلسل الجيل التالي ، وخوارزمية جديدة (34). This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. قلل هذا النهج بشكل كبير من إجمالي مقدار التسلسل المطلوب ، وخفض التكاليف ووقت الفحص ، وتمكين التحليل السريع. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. ومع ذلك ، نظرًا لأن هذا الاختبار يعتمد على الاختلافات في MAF بين الأفراد ، فإنه لن يكون قويًا لأزواج المانحين والمتلقين الوثيقة الصلة ، كما هو موضح في التبرع بالكلى المرتبط بالمعيشة. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. يبقى التحقق من صحة الكشف عن أحداث الرفض المعتدلة أو أكبر.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). وقد استكشفت المختبرات أيضًا استخدام SNPs متعددة الأشكال لتحديد كمية dd-cfDNA جنبًا إلى جنب مع تقنية PCR الرقمية (30،35-37). Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). باستخدام 41 من SNPs متعددة الأشكال للغاية ، أظهر المستقرون في الكلى و HT أجزاء من dd-cfDNA من 2٪ إلى 3٪ مع متلقي زرع الكبد بمستوى 7٪ (35).
الاستنتاجات
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. استخدام خزعة أنسجة مكلفة وغزوية للكشف عن رفض طعم خيالي له قيود كبيرة. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. على هذا النحو ، فإن الفحص طفيف التوغل الذي يمكنه تقييم صحة العضو المزروع بأكمله بدقة ودقة يمثل الكأس المقدسة في زرع الأعضاء الصلبة.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. أظهر استخدام cfDNA بعد الزرع بعض الوعود الأولية ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة والتحقق من الصحة لتحسين فهمنا لكل من البيولوجيا الأساسية لـ cfDNA وسلوكه بعد الزرع. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. في هذا الوقت ، من الواضح أن هناك اختلافات مهمة خاصة بالأعضاء ، وأنماط إطلاق cfDNA قد تختلف أيضًا اعتمادًا على نوع حدث الرفض. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. ومع ذلك ، يمثل cfDNA واحدة من أكثر التقنيات الواعدة التي تم تطويرها لتكمل خزعة الأنسجة أو حتى استبدالها في النهاية.
التشخيص القائم على cfDNA يمكن أن يجعل خزعة الأنسجة قديمة
Costly and invasive tissue biopsies to detect allograft rejection after transplantation have numerous limitations. الخزعات المكلفة والغازية للكشف عن رفض الطعم بعد الزرع لها قيود عديدة. Assays based on cell-free DNA (cfDNA)—circulating fragments of DNA released from cells, tissues, and organs as they undergo natural cell death—have been intensively studied recently and could ultimately improve our ability to detect rejection, implement earlier changes in management, and even enhance the long-term survival of transplanted organs. خضعت الفحوصات المستندة إلى الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) - وهي أجزاء متداولة من الحمض النووي المنطلق من الخلايا والأنسجة والأعضاء أثناء موت الخلايا الطبيعية - إلى دراسة مكثفة مؤخرًا ويمكن أن تحسن في نهاية المطاف قدرتنا على اكتشاف الرفض وتنفيذ التغييرات السابقة في الإدارة ، وحتى تعزيز البقاء على المدى الطويل للأعضاء المزروعة.
CfDNA assays that circumvent the need for whole-genome sequencing (WGS) and the need for a priori knowledge of donor and/or recipient genotypes have powerful logistical advantages and are currently under clinical scrutiny. تفترض CfDNA أن التحايل على الحاجة إلى تسلسل الجينوم الكامل (WGS) والحاجة إلى معرفة مسبقة بالأنماط الجينية المتبرعة و / أو المتلقية لها مزايا لوجستية قوية وهي حاليًا قيد الفحص السريري. In addition, improving knowledge of the organ-specific kinetics of donor-derived cfDNA (dd-cfDNA) following transplantation has also helped optimize these assays. بالإضافة إلى ذلك ، ساعد تحسين معرفة الحركية الخاصة بالأعضاء في cfDNA المشتقة من الجهات المانحة (dd-cfDNA) بعد الزرع أيضًا على تحسين هذه المقايسات. Laboratories also have introduced alternative methods for quantifying dd-cfDNA, such as digital droplet polymerase chain reaction (PCR) and organ-specific DNA methylation patterns. أدخلت المختبرات أيضًا طرقًا بديلة لقياس كمية dd-cfDNA ، مثل تفاعل سلسلة البلمرة المتسلسلة الرقمية (PCR) وأنماط مثيلة DNA DNA الخاصة بالأعضاء. As such, the field of minimally invasive diagnostics based upon cfDNA is increasingly promising, one day potentially replacing traditional tissue biopsies. على هذا النحو ، يعد مجال التشخيصات الأقل بضعاً القائم على cfDNA واعدًا بشكل متزايد ، ويحتمل في يوم من الأيام استبدال الخزعات التقليدية للأنسجة.
دور CFDNA في الرفض العضوي
Rejection, referring to injury of a donated organ caused by the recipient's immune system, can cause allograft dysfunction and even patient death. الرفض ، يشير إلى إصابة العضو المتبرع به بسبب الجهاز المناعي للمتلقي ، يمكن أن يسبب خللًا في وظيفة الطعم الخيالي وحتى وفاة المريض. T-cell mediated acute cellular rejection (ACR) occurs most often within the first 6 months post-transplant (1). يحدث الرفض الخلوي الحاد بوساطة الخلايا التائية (ACR) في أغلب الأحيان خلال الأشهر الستة الأولى بعد الزرع (1). ACR involves accumulation of CD4+ and CD8+ T-cells in the interstitial space of the allograft as the recipient's immune system recognizes antigens on the donated organ as foreign. ينطوي ACR على تراكم خلايا CD4 + و CD8 + T في الفضاء الخلالي للطعم الخيالي حيث يتعرف نظام المناعة لدى المستلم على المستضدات على العضو المتبرع به كأجنبي. These T-cells initiate an immune cascade that ultimately leads to programmed cell death (apoptosis) of the targeted cells. تبدأ هذه الخلايا التائية في شلال مناعي يؤدي في النهاية إلى موت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) للخلايا المستهدفة. As these cells die, genomic DNA is cleaved and fragments of dd-cfDNA, measuring approximately 140 base pairs (bp) in length, are released to join the pool of recipient cfDNA in the blood and ultimately excreted in the urine (2). عندما تموت هذه الخلايا ، يتم انقسام DNA الجينومي ويتم إطلاق شظايا من dd-cfDNA ، بقياس حوالي 140 زوجًا أساسيًا (bp) ، للانضمام إلى تجمع cfDNA المتلقي في الدم ويتم إخراجه في النهاية في البول (2).
Circulating cfDNA has recently been leveraged as a diagnostic tool to replace invasive biopsies in other areas of medicine, including analyzing fetal DNA fragments within the maternal circulation to identify genetic abnormalities in utero and sequencing circulating DNA released from tumor cells to identify cancer-related mutations. تم استخدام cfDNA المتداول مؤخرًا كأداة تشخيصية لتحل محل الخزعات الغازية في مجالات أخرى من الطب ، بما في ذلك تحليل شظايا DNA الجنينية داخل الدورة الأمومية لتحديد التشوهات الوراثية في الرحم وتسلسل DNA المنتشر من الخلايا السرطانية لتحديد الطفرات المرتبطة بالسرطان. In both these cases as well as in transplantation, high-throughput sequencing that identifies and quantifies DNA sequence differences distinguishes between the two different populations of cfDNA derived from distinct sources (2). في كلتا الحالتين وكذلك في عملية الزرع ، يميز التسلسل عالي الإنتاجية الذي يحدد ويقيس اختلافات تسلسل الحمض النووي بين المجموعتين المختلفتين من cfDNA المستمدة من مصادر مميزة (2). Three characteristics of cfDNA make it an excellent noninvasive candidate biomarker to detect rejection after solid organ transplantation: It can be obtained from a simple blood draw, its concentration accurately measured, and its nucleotide sequence easily identified. هناك ثلاث خصائص لـ cfDNA تجعلها علامة بيولوجية مرشحة ممتازة غير باضعة للكشف عن الرفض بعد زرع الأعضاء الصلبة: يمكن الحصول عليها من سحب الدم البسيط ، وقياس تركيزه بدقة ، وتسلسل النوكليوتيدات بسهولة تحديده. Using cfDNA as a biomarker for ACR is also advantageous since it is derived from the injured cells of the donated organ and therefore should represent a direct measure of cell death occurring in the allograft. استخدام cfDNA كمؤشر حيوي لـ ACR مفيد أيضًا لأنه مشتق من الخلايا المصابة في العضو المتبرع به ، وبالتالي يجب أن يمثل مقياسًا مباشرًا لموت الخلية الذي يحدث في الطعم المغاير. Furthermore, cfDNA maintains all of the genetic features of the original genomic DNA, allowing the genetic material released from the donated organ to be differentiated from the cfDNA derived from cells of the recipient that are undergoing natural apoptosis (3). علاوة على ذلك ، يحافظ cfDNA على جميع السمات الجينية للحمض النووي الجينومي الأصلي ، مما يسمح بالتمييز بين المادة الوراثية المنبعثة من العضو المتبرع به عن cfDNA المستمدة من خلايا المتلقي التي تخضع لاستماتة طبيعية (3).
Frequent and accurate monitoring of allograft health is essential for transplant recipients' long-term survival. يعد الرصد المتكرر والدقيق لصحة الطعم أمرًا ضروريًا لبقاء المتلقين على المدى الطويل. For heart transplantation (HT), endomyocardial biopsy (EMB) is the current gold standard for detecting ACR (4). لزرع القلب (HT) ، خزعة بطانة القلب (EMB) هي المعيار الذهبي الحالي للكشف عن ACR (4). However, EMBs are costly with significant limitations, many of which are common to all organ biopsies (5-7). ومع ذلك ، فإن الإدارة الانتخابية مكلفة مع قيود كبيرة ، وكثير منها مشترك لجميع خزعات الأعضاء (5-7). Moreover, the invasive nature of EMBs puts HT patients at risk for complications (6,8,9). علاوة على ذلك ، فإن الطبيعة الغازية لمؤسسات الإدارة الانتخابية تضع مرضى HT في خطر الإصابة بمضاعفات (6،8،9).
Unfortunately, currently available noninvasive methods including echocardiography or magnetic resonance imaging (MRI) lack sufficient specificity and sensitivity to reliably detect rejection (10-13). لسوء الحظ ، تفتقر الطرق غير الجراحية المتاحة حاليًا بما في ذلك تخطيط صدى القلب أو التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) إلى الخصوصية والحساسية الكافية للكشف بشكل موثوق عن الرفض (10-13). Blood-based biomarkers, such as cfDNA, represent a promising alternative that could be readily implemented into clinical practice (14-17). تمثل المؤشرات الحيوية القائمة على الدم ، مثل cfDNA ، بديلاً واعدًا يمكن تنفيذه بسهولة في الممارسة السريرية (14-17).
حركية CFDNA خلال الهدوء والاعتراض
Since cfDNA originates from the naturally occurring process of apoptosis, all individuals have detectable levels of cfDNA in their blood (18). نظرًا لأن cfDNA ينشأ من عملية الاستموات التي تحدث بشكل طبيعي ، فإن جميع الأفراد لديهم مستويات يمكن اكتشافها من cfDNA في دمائهم (18). For healthy individuals, the majority of circulating cfDNA comes from hematopoietic cells that have undergone natural death related to cellular turnover. بالنسبة للأفراد الأصحاء ، تأتي غالبية cfDNA المنتشرة من خلايا المكونة للدم التي خضعت لموت طبيعي مرتبط بالدوران الخلوي. Levels of cfDNA fluctuate for multiple reasons including infection, surgery, trauma, or even exhaustive exercise (2,19). تتقلب مستويات cfDNA لأسباب متعددة بما في ذلك العدوى أو الجراحة أو الصدمة أو حتى التمارين الشاملة (2،19). Therefore, developing a cfDNA-based assay to detect rejection requires assessing the expected kinetics of dd-cfDNA release into the recipient's circulation post-transplant. لذلك ، يتطلب تطوير مقايسة تعتمد على cfDNA للكشف عن الرفض تقييم الخواص المتوقعة لإطلاق dd-cfDNA في الدورة الدموية للمستقبل بعد الزرع. This consideration is especially important since the release of dd-cfDNA over time post-transplant is organ-specific (20-22). هذا الاعتبار مهم بشكل خاص لأن إطلاق dd-cfDNA بمرور الوقت بعد الزرع هو خاص بالأعضاء (20-22).
For example, at 1 day post-HT the average level of dd-cfDNA is 3.8 ± 2.3% (20). على سبيل المثال ، في يوم واحد بعد HT ، يبلغ متوسط مستوى dd-cfDNA 3.8 ± 2.3٪ (20). However, by 7 days the level of dd-cfDNA has declined rapidly and remains consistently low (<1%). ومع ذلك ، وبحلول 7 أيام ، انخفض مستوى dd-cfDNA بسرعة ولا يزال منخفضًا باستمرار (<1٪). During an episode of acute rejection in the heart, the level of dd-cfDNA was found to increase to 4%–5% from a baseline of about 0.06% observed during quiescence. خلال نوبة الرفض الحاد في القلب ، وجد أن مستوى dd-cfDNA يزداد إلى 4٪ - 5٪ من خط الأساس لحوالي 0.06٪ الذي لوحظ خلال فترة السكون. The kinetics of dd-cfDNA observed in the circulation of HT recipients was similar to that observed after renal transplantation (22). كانت حركية dd-cfDNA التي لوحظت في تداول متلقي HT مماثلة لتلك التي لوحظت بعد الزرع الكلوي (22).
In contrast, recipients of bilateral lung transplants were found to have an average dd-cfDNA fraction of 26 ± 14% on the first postoperative day. في المقابل ، وجد أن المتلقين لعمليات زرع الرئة الثنائية لديهم متوسط جزء dd-cfDNA من 26 ± 14٪ في اليوم الأول بعد الجراحة. Furthermore, the reduction in dd-cfDNA was characterized by levels of dd-cfDNA that declined rapidly within the first week but then slowed and generally remained at 1%–3% (21). علاوة على ذلك ، اتسم الانخفاض في dd-cfDNA بمستويات dd-cfDNA التي تراجعت بسرعة خلال الأسبوع الأول ثم تباطأت وبقيت بشكل عام عند 1٪ -3٪ (21). However, similar to heart and kidney transplants during an episode of acute rejection, the level of dd-cfDNA increased significantly, climbing to an average of 14%–15%. ومع ذلك ، على غرار عمليات زرع القلب والكلى خلال حلقة من الرفض الحاد ، زاد مستوى dd-cfDNA بشكل ملحوظ ، حيث ارتفع إلى متوسط 14 ٪ -15 ٪.
Differences in tissue mass and rates of cellular turnover account for this variability in the levels of dd-cfDNA released early post-transplant and during quiescence. تفسر الاختلافات في كتلة الأنسجة ومعدلات دوران الخلايا لهذا التباين في مستويات dd-cfDNA التي تم إطلاقها في وقت مبكر بعد الزرع وأثناء السكون. For example, differences in circulating dd-cfDNA levels in quiescent bilateral and single-lung transplants can be explained by the difference in cellular turnover, being 107 vs. 58 cells/second, respectively (21). على سبيل المثال ، يمكن تفسير الاختلافات في تعميم مستويات dd-cfDNA في عمليات زرع ثنائية وثنائية الرئة الهادئة عن طريق الاختلاف في دوران الخلايا ، كونها 107 مقابل 58 خلية / ثانية ، على التوالي (21). By contrast, in a quiescent transplanted heart, the cellular turnover rate is only 8 cells/second (21-23). على النقيض من ذلك ، في القلب الهادئ المزروع ، يبلغ معدل دوران الخلايا 8 خلايا فقط في الثانية (21-23). Thus, an understanding of the expected levels of dd-cfDNA associated with a given solid organ is essential to facilitate development of organ-specific assays that detect rejection. وبالتالي ، فإن فهم المستويات المتوقعة من dd-cfDNA المرتبط بعضو صلب معين أمر ضروري لتسهيل تطوير الاختبارات الخاصة بالأعضاء التي تكشف عن الرفض. Once the kinetics of cfDNA release for a particular organ are understood, several methods exist for quantifying the relative amount of dd-cfDNA. بمجرد فهم حركيات إطلاق cfDNA لعضو معين ، توجد عدة طرق لتحديد الكمية النسبية لـ dd-cfDNA.
STRATEGIES TO DISTINGUISH RECIPIENT- VS. استراتيجيات تمييز المستفيد - ضد. DONOR-DERIVED CFDNA CFDNA مشتقة من DONOR
عدم تطابق الجنس بين المتلقي والمتلقي
For organ transplants in which the donor is male and the recipient is female, laboratories can leverage this sex mismatch to calculate dd-cfDNA levels from within the recipient's total cfDNA pool (17). بالنسبة لعمليات زرع الأعضاء التي يكون فيها المتبرع ذكرًا والمتلقي أنثى ، يمكن للمختبرات الاستفادة من عدم التطابق الجنسي هذا لحساب مستويات dd-cfDNA من داخل مجموع cfDNA الخاص بالمستلم (17). Researchers first demonstrated the feasibility of this approach in urine samples taken from female renal transplant recipients who had received a kidney from male donors and when they experienced rejection demonstrated elevated levels of dd-cfDNA in their urine that specifically contained regions found on the Y chromosome (17). أظهر الباحثون لأول مرة جدوى هذا النهج في عينات البول المأخوذة من الإناث المتلقين لعملية زرع الكلى الذين تلقوا الكلى من المتبرعين الذكور ، وعندما عانوا من الرفض ، أظهروا مستويات مرتفعة من dd-cfDNA في بولهم الذي يحتوي على مناطق موجودة على الكروموسوم Y بشكل خاص ( 17). Although this approach allows for confident diagnosis of rejection in the allograft, sex-mismatch between the donor and recipient is relatively infrequent and not universally applicable. على الرغم من أن هذا النهج يسمح بالتشخيص الواثق للرفض في الطعم المغاير ، فإن عدم تطابق الجنس بين المتبرع والمتلقي نادر الحدوث وغير قابل للتطبيق عالميًا.
الاختلافات في تسلسل الحمض النووي بين الجهات المانحة والمتلقية
An organ transplant can also be regarded as a genome transplant, as the cells within a transplanted organ contain the genetic information of its donor. يمكن أيضًا اعتبار عملية زرع الأعضاء عملية زرع جينوم ، حيث تحتوي الخلايا الموجودة داخل العضو المزروع على المعلومات الوراثية للمتبرع له. As such, the concept of genome transplant dynamics (GTD) relies on the presence of genetic differences between the donor and recipient at a particular locus, which then can be leveraged to identify the origin of the circulating cfDNA (20-24). على هذا النحو ، يعتمد مفهوم ديناميات زرع الجينوم (GTD) على وجود اختلافات جينية بين المتبرع والمتلقي في موضع معين ، والتي يمكن الاستفادة منها لتحديد أصل cfDNA المتداول (20-24). Ideally, the recipient would be homozygous for a single base (for example, AA) and at the same locus the donor would be homozygous for a different base (for example, GG). من الناحية المثالية ، سيكون المتلقي متماثل الزيجوت لقاعدة واحدة (على سبيل المثال ، AA) وفي نفس المكان يكون المتبرع متماثلًا لقاعدة مختلفة (على سبيل المثال ، GG).
Given the genetic heterogeneity between individuals, tens of thousands of potentially informative loci across the genome can be interrogated using high-throughput sequencing to distinguish dd-cfDNA from recipient cfDNA (20,24). بالنظر إلى عدم التجانس الوراثي بين الأفراد ، يمكن استجواب عشرات الآلاف من المواقع التي قد تكون غنية بالمعلومات عبر الجينوم باستخدام التسلسل عالي الإنتاجية للتمييز بين dd-cfDNA و cfDNA المتلقي (20،24). This concept was first illustrated using banked samples from cardiac donors to obtain a priori donor genotypes for each donor-recipient pairing. تم توضيح هذا المفهوم لأول مرة باستخدام عينات مصرفية من المتبرعين القلبيين للحصول على أنماط وراثية مسبقة من كل متبرع لكل زوج. After extracting and sequencing cfDNA from each recipient, the fraction of donor-specific molecules was determined. بعد استخراج وتسلسل cfDNA من كل متلقي ، تم تحديد جزء الجزيئات الخاصة بالجهات المانحة. In samples taken during or immediately preceding a biopsy-proven rejection event, the proportion of donor-specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) was found to have increased from <1% to >3%–4% (24). في العينات المأخوذة أثناء أو قبل حدث رفض مثبت للخزعة ، تبين أن نسبة تعدد أشكال النوكليوتيدات الفردية الخاصة بالجهات المانحة قد زادت من <1٪ إلى> 3٪ - 4٪ (24).
This early retrospective study has now been validated prospectively. تم التحقق من صحة هذه الدراسة الاسترجاعية المبكرة مستقبلاً. Adult and pediatric heart and lung transplant recipients were recruited and genotypes for each donor-recipient pair were obtained through WGS with an average of 53,423 informative SNP markers identified (20). تم تجنيد الأشخاص البالغين والأطفال في القلب وزرع الرئة وتم الحصول على الأنماط الجينية لكل زوج من المتبرعين والمتلقيين من خلال WGS بمتوسط 53.423 علامات SNP إعلامية تم تحديدها (20). Overall, early detection of acute rejection was superior to that of AlloMap, the first Food and Drug Administration-approved non-invasive approach to detecting ACR after HT based on transcriptome analysis (25). بشكل عام ، كان الكشف المبكر عن الرفض الحاد أعلى من AlloMap ، وهو أول نهج غير جراحي معتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء للكشف عن ACR بعد HT بناءً على تحليل transcriptome (25).
Research also has shown that WGS not only provides information about a graft but also a patient's virome and overall state of immunosuppression. وقد أظهرت الأبحاث أيضًا أن WGS لا توفر فقط معلومات حول الكسب غير المشروع ولكن أيضًا فيروم المريض والحالة العامة لقمع المناعة. This represents a potentially great advantage unobtainable by other assays (26-28). هذا يمثل ميزة كبيرة محتملة لا يمكن الحصول عليها بواسطة المقايسات الأخرى (26-28).
However, WGS faces challenges that could prevent it from being implemented routinely in clinical practice. ومع ذلك ، تواجه WGS تحديات يمكن أن تحول دون تنفيذها بشكل روتيني في الممارسة السريرية. For example, while a recipient's genetic information can be easily obtained, this is not always true for a donor. على سبيل المثال ، في حين أنه يمكن الحصول على المعلومات الجينية للمستلم بسهولة ، فإن هذا لا ينطبق دائمًا على المتبرع. Moreover, WGS is costly, labor intensive, and time-consuming. علاوة على ذلك ، فإن WGS مكلفة ومكلفة للعمل وتستغرق وقتًا طويلاً.
An alternative method employs a panel of genotyped polymorphic SNPs identified within the pool of extracted cfDNA thereby eliminating the need for a priori knowledge of a donor's specific genotype (29). تستخدم طريقة بديلة لوحة من SNPs متعددة الأشكال الجينية تم تحديدها داخل تجمع cfDNA المستخرج وبالتالي القضاء على الحاجة إلى معرفة مسبقة من النمط الجيني المحدد للمتبرع (29). Unlike kidney and liver transplants, which often occur between closely related individuals, the donor-recipient pairs for heart and lung transplants typically are not related. على عكس عمليات زرع الكلى والكبد ، والتي تحدث غالبًا بين الأفراد المتصلين ارتباطًا وثيقًا ، فإن أزواج المتبرعين والمتلقين لعمليات زرع القلب والرئة لا ترتبط عادةً. GTD requires genotyping of both the transplant recipient and donor. يتطلب مرض ورم الأرومة الغاذية الحملي التنميط الجيني لكل من متلقي الزرع والمتبرع. However, in practice, donor genotype information is often unavailable. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، غالبًا ما تكون معلومات النمط الجيني للجهات المانحة غير متوفرة. Here, we address this issue by developing an algorithm that estimates dd-cfDNA levels in the absence of a donor genotype. هنا ، نعالج هذه المشكلة من خلال تطوير خوارزمية تقدر مستويات dd-cfDNA في غياب النمط الجيني المانحة. Our algorithm predicts heart and lung allograft rejection with an accuracy that is similar to conventional GTD. تتنبأ خوارزمياتنا برفض الطعم الخيطي للقلب والرئة بدقة مماثلة لـ GTD التقليدي. We furthermore refined the algorithm to handle closely related recipients and donors, a scenario that is common in bone marrow and kidney transplantation. علاوة على ذلك ، قمنا بتحسين الخوارزمية للتعامل مع المتلقين والمتبرعين ذوي الصلة الوثيقة ، وهو سيناريو شائع في نخاع العظام وزرع الكلى. We show that it is possible to estimate dd-cfDNA in bone marrow transplant patients who are unrelated or who are siblings of the donors, using a hidden Markov model. نظهر أنه من الممكن تقدير dd-cfDNA في مرضى زرع النخاع العظمي الذين ليس لديهم علاقة أو هم أشقاء من المتبرعين ، باستخدام نموذج ماركوف المخفي. Therefore, algorithms have been developed for heart and lung transplants which assume that the donor's genotype occurs at the same frequency as the general population. لذلك ، تم تطوير خوارزميات لزرع القلب والرئة والتي تفترض أن النمط الجيني للمتبرع يحدث بنفس تواتر عامة السكان. Based on these frequencies and comparison to the known genotype of the recipient, the fraction of dd-cfDNA can be reliably estimated from the total pool of cfDNA isolated from a recipient's plasma sample. استنادًا إلى هذه الترددات والمقارنة مع النمط الجيني المعروف للمستلم ، يمكن تقدير جزء من dd-cfDNA بشكل موثوق من إجمالي مجموعة cfDNA المعزولة من عينة بلازما المستلم.
In the case of lung transplantation, this single-genome model, when compared to the methodology using both donor and recipient genotypes, was found to provide comparable fractions of dd-cfDNA. في حالة زرع الرئة ، وجد أن نموذج الجينوم المفرد هذا ، عند مقارنته بالمنهجية التي تستخدم كلاً من الأنماط الجينية المانحة والمتلقية ، يوفر أجزاء مماثلة من dd-cfDNA. However, when researchers applied this same algorithm to HT, the estimated levels of dd-cfDNA were not as strongly correlated as in lung transplants. ومع ذلك ، عندما طبق الباحثون نفس الخوارزمية على HT ، لم تكن المستويات المقدرة من dd-cfDNA مرتبطة ارتباطًا وثيقًا كما هو الحال في عمليات زرع الرئة. This might be related to the lower absolute amounts of dd-cfDNA present after HT. قد يكون هذا مرتبطًا بالمبالغ المطلقة المنخفضة لـ dd-cfDNA الموجودة بعد HT. This is another example of organ-specific cfDNA kinetics that can influence assay results and must be taken into account (30). هذا مثال آخر على حركية cfDNA الخاصة بالأعضاء والتي يمكن أن تؤثر على نتائج الفحص ويجب أخذها في الاعتبار (30).
In the case of renal transplantation, prospective studies have been conducted to ascertain the utility of dd-cfDNA levels, identified using known donor-specific SNPs, as a viable marker for rejection. في حالة الزرع الكلوي ، تم إجراء دراسات مستقبلية للتأكد من فائدة مستويات dd-cfDNA ، التي تم تحديدها باستخدام SNPs المعروفة الخاصة بالجهات المانحة ، كعلامة قابلة للتطبيق للرفض. In one such study, 384 kidney recipients were recruited from 14 clinical sites to provide blood samples at scheduled intervals and at times of clinically indicated biopsies (31). في إحدى هذه الدراسات ، تم تجنيد 384 من متلقي الكلى من 14 موقعًا سريريًا لتقديم عينات الدم على فترات محددة وفي أوقات الخزعات الموضحة سريريًا (31). Overall, the study focused on the correlation between the histology in 107 biopsy specimens from 102 patients and the levels of dd-cfDNA found in matched plasma samples. بشكل عام ، ركزت الدراسة على العلاقة بين الأنسجة في 107 عينات خزعة من 102 مريض ومستويات dd-cfDNA الموجودة في عينات البلازما المتطابقة. More specifically, 27 biopsy samples from 27 patients with active rejection were obtained along with 80 biopsy samples from 75 patients without active rejection. وبشكل أكثر تحديدًا ، تم الحصول على 27 عينة خزعة من 27 مريضًا مع الرفض النشط جنبًا إلى جنب مع 80 عينة خزعة من 75 مريضًا دون رفض نشط.
In this study, active rejection included acute antibody-mediated rejection (AMR), chronic AMR, and ACR. في هذه الدراسة ، تضمن الرفض النشط الرفض الحاد بوساطة الأجسام المضادة (AMR) ، و AMR المزمن ، و ACR. The assay used in this study employed a 1% cutoff for the fraction of dd-cfDNA to indicate the presence or absence of active rejection and was found to have 85% specificity (95% CI, 79%–91%) and 59% sensitivity (95% CI, 44%–74%). استخدمت المقايسة المستخدمة في هذه الدراسة قطعًا بنسبة 1 ٪ لجزء من dd-cfDNA للإشارة إلى وجود أو عدم وجود رفض نشط ووجد أن لديه خصوصية 85 ٪ (95 ٪ CI ، 79 ٪ - 91 ٪) وحساسية 59 ٪ (95٪ مجال ثقة ، 44٪ -74٪). The sensitivity of this assay was greater for discriminating between active and absent AMR, as the use of a cutoff of 1% dd-cfDNA was found to have an 83% specificity (95% CI, 78%–89%) and 81% sensitivity (95% CI, 67%–100%). كانت حساسية هذا الاختبار أكبر للتمييز بين AMR النشط والغياب ، حيث وجد أن استخدام 1٪ dd-cfDNA له خصوصية 83٪ (95٪ CI ، 78٪ -89٪) و 81٪ حساسية (95٪ مجال ثقة ، 67٪ - 100٪). Notably, in both cases, the sensitivity declined substantially when the fraction of dd-cfDNA exceeded 3%. ومن الجدير بالذكر ، في كلتا الحالتين ، انخفضت الحساسية بشكل كبير عندما تجاوز جزء dd-cfDNA 3٪.
To improve specificity and sensitivity of a non-invasive cfDNA-based assay to detect rejection following renal transplantation, investigators also have surveyed the absolute amount of dd-cfDNA (32-33). لتحسين خصوصية وحساسية مقايسة cfDNA غير الغازية للكشف عن الرفض بعد الزرع الكلوي ، قام الباحثون أيضًا بمسح الكمية المطلقة من dd-cfDNA (32-33). By interrogating the absolute amount of dd-cfDNA, one can eliminate the artificial changes in the fraction of dd-cfDNA due to increases in total cfDNA levels caused by non-rejection events, such as infection, trauma, or exercise, potentially creating a more accurate assay. من خلال استجواب الكمية المطلقة من dd-cfDNA ، يمكن للمرء أن يزيل التغييرات الاصطناعية في جزء dd-cfDNA بسبب الزيادات في مستويات cfDNA الإجمالية الناجمة عن أحداث عدم الرفض ، مثل العدوى أو الصدمة أو التمرين ، مما قد يخلق المزيد من فحص دقيق.
To investigate this possibility, one study employed 32 informative copy number variants (CNVs) based on population frequencies, as opposed to relative proportions of donor and recipient SNPs at given loci (32). للتحقيق في هذا الاحتمال ، استخدمت إحدى الدراسات 32 متغيرًا لأرقام النسخ الإعلامية (CNVs) استنادًا إلى الترددات السكانية ، على النقيض من النسب النسبية لـ SNPs المانحة والمتلقية في مكان معين (32). All CNVs not present within a recipient's genome but present within the extracted cfDNA were therefore assumed to represent dd-cfDNA. لذلك ، افترض أن جميع CNVs غير موجودة داخل جينوم المتلقي ولكنها موجودة داخل cfDNA المستخرج تمثل dd-cfDNA.
Interestingly, while the specificity and sensitivity improved overall with the use of absolute dd-cfDNA levels, this assay also had a greater capacity to distinguish between the presence and absence of active AMR, as opposed to cases of active ACR. ومن المثير للاهتمام ، أنه بينما تحسنت الخصوصية والحساسية بشكل عام باستخدام مستويات dd-cfDNA المطلقة ، كان لهذا الاختبار أيضًا قدرة أكبر على التمييز بين وجود وغياب AMR النشط ، على عكس حالات ACR النشط. In addition, serum creatinine levels were not sufficient in discriminating between active rejection and quiescence, likely because it is more indicative of glomerular function as opposed to kidney tissue damage (31-33). بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن مستويات الكرياتينين في الدم كافية في التمييز بين الرفض النشط والهدوء ، على الأرجح لأنها أكثر دلالة على وظيفة الكبيبة على عكس تلف أنسجة الكلى (31-33).
Another study explored the absolute levels of dd-cfDNA in kidney transplant recipients related to levels of tacrolimus, an immunosuppressant (33). استكشفت دراسة أخرى المستويات المطلقة لـ dd-cfDNA في متلقي عمليات زرع الكلى المتعلقة بمستويات تاكروليماس ، وهو مثبط مناعي (33). Here, the researchers found that the absolute amount of dd-cfDNA was substantially higher in patients with lower tacrolimus levels (<8 μg/L) in comparison to those with higher drug levels. هنا ، وجد الباحثون أن الكمية المطلقة من dd-cfDNA كانت أعلى بشكل كبير في المرضى الذين يعانون من انخفاض مستويات التاكروليماس (<8 ميكروغرام / لتر) مقارنة مع أولئك الذين لديهم مستويات أدوية أعلى. These data suggest that dd-cfDNA levels also have the potential to detect allograft injury resulting from inadequate immunosuppression. تشير هذه البيانات إلى أن مستويات dd-cfDNA لديها أيضًا القدرة على الكشف عن إصابة طعم خيفي ناتجة عن عدم كفاية المناعة.
Laboratories also have proposed alternatives to WGS. كما اقترحت المختبرات بدائل لـ WGS. Our group explored targeted sequencing of 124 highly polymorphic (minor allele frequency [MAF] >0.4) SNPs using a commercially available panel, next-generation sequencing, and a novel algorithm (34). استكشفت مجموعتنا التسلسل المستهدف لـ 124 SNPs متعددة الأشكال (تردد أليل طفيف [MAF]> 0.4) باستخدام لوحة متاحة تجاريًا ، وتسلسل الجيل التالي ، وخوارزمية جديدة (34). This approach significantly reduced the total amount of sequencing required, decreasing costs and assay time, and enabling rapid analysis. قلل هذا النهج بشكل كبير من إجمالي مقدار التسلسل المطلوب ، وخفض التكاليف ووقت الفحص ، وتمكين التحليل السريع. However, since this assay relies upon differences in MAF between individuals, it would not be robust for closely related donor–recipient pairs, such as seen in living-related kidney donation. ومع ذلك ، نظرًا لأن هذا الاختبار يعتمد على الاختلافات في MAF بين الأفراد ، فإنه لن يكون قويًا لأزواج المانحين والمتلقين الوثيقة الصلة ، كما هو موضح في التبرع بالكلى المرتبط بالمعيشة. It remains to be validated for detecting moderate or greater rejection events. يبقى التحقق من صحة الكشف عن أحداث الرفض المعتدلة أو أكبر.
Laboratories also have explored using polymorphic SNPs to quantify dd-cfDNA combined with the technology of digital droplet PCR (30,35-37). وقد استكشفت المختبرات أيضًا استخدام SNPs متعددة الأشكال لتحديد كمية dd-cfDNA جنبًا إلى جنب مع تقنية PCR الرقمية (30،35-37). Using 41 highly polymorphic SNPs, stable kidney and HT recipients showed dd-cfDNA fractions of 2%–3% with stable liver transplant recipients having a level of 7% (35). باستخدام 41 من SNPs متعددة الأشكال للغاية ، أظهر المستقرون في الكلى و HT أجزاء من dd-cfDNA من 2٪ إلى 3٪ مع متلقي زرع الكبد بمستوى 7٪ (35).
الاستنتاجات
The use of a costly and invasive tissue biopsy to detect allograft rejection has significant limitations. استخدام خزعة أنسجة مكلفة وغزوية للكشف عن رفض طعم خيالي له قيود كبيرة. As such, a minimally invasive assay that can directly and accurately assess the health of the entire transplanted organ represents a holy grail in solid organ transplantation. على هذا النحو ، فإن الفحص طفيف التوغل الذي يمكنه تقييم صحة العضو المزروع بأكمله بدقة ودقة يمثل الكأس المقدسة في زرع الأعضاء الصلبة.
The use of cfDNA after transplantation has shown some initial promise, but further study and validation is required to improve our understanding of both the basic biology of cfDNA as well as its behavior post-transplant. أظهر استخدام cfDNA بعد الزرع بعض الوعود الأولية ، ولكن هناك حاجة إلى مزيد من الدراسة والتحقق من الصحة لتحسين فهمنا لكل من البيولوجيا الأساسية لـ cfDNA وسلوكه بعد الزرع. At this time, it is clear that important organ-specific differences exist, and patterns of cfDNA release may also differ depending on the type of rejection event. في هذا الوقت ، من الواضح أن هناك اختلافات مهمة خاصة بالأعضاء ، وأنماط إطلاق cfDNA قد تختلف أيضًا اعتمادًا على نوع حدث الرفض. However, cfDNA represents one of the most promising technologies yet developed to complement or even ultimately replace the tissue biopsy. ومع ذلك ، يمثل cfDNA واحدة من أكثر التقنيات الواعدة التي تم تطويرها لتكمل خزعة الأنسجة أو حتى استبدالها في النهاية.
